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Qual amostra para o VIDOC-19: nasofaríngea ou oral?

Texto atualizado em 2020-06-03


Os esfregaços orais são preferíveis porque permitem a amostragem autónoma, são mais fáceis e menos perigosos em termos de contaminação. Os Estados Unidos, Japão, Suíça, Austrália, Itália e Reino Unido utilizam-nos.

Embora o esfregaço nasofaríngeo tenha sido o teste de referência desde o início da epidemia, muitos países estão a tirar partido dos esfregaços orais, que implicam menos riscos para o amostrador e não requerem equipamento de protecção pessoal.

Numerosos estudos em Itália, Austrália, Hong Kong, Banguecoque, Japão e Estados Unidos (Connecticut e Califórnia) mostram que o coronavírus SRA-CoV-2 é detectável em esfregaços orais durante várias semanas após o início dos sintomas e na saliva de casos assintomáticos. Após a fluidificação e extracção do RNA viral, a sensibilidade de detecção é tão boa como com os esfregaços nasofaríngeos, uma vez que a carga viral é elevada e é utilizada a mesma técnica de PCR. Recomenda-se que o paciente seja mantido jovem por 2 horas antes da coleta. Nestas condições, o coronavírus geralmente permanece na saliva durante 4-5 semanas, mais tempo do que o que normalmente se encontra no esfregaço nasal. 

Na prática, os esfregaços orais são tomados de várias maneiras: 

O Sputum parece ser o meio mais fiável de detectar o SRA-CoV-2, mas ainda não foram feitos estudos comparativos sistemáticos. Como o SRA-CoV-2 reside nas vias respiratórias, a expectoração salivar permitiria a recolha de fluidos orais e brônquicos na mesma amostra, aumentando assim as hipóteses de detecção do coronavírus.

Os esfregaços orais têm vantagens práticas sobre os esfregaços nasofaríngeos:

(1) É muito fácil recolher saliva ou expectoração. Esta amostra pode ser dada àqueles que estão sendo testados, incluindo crianças, sem expor outros ao coronavírus. Pelo contrário, o esfregaço nasofaríngeo é delicado e invasivo e pode causar dor ou desconforto. Muitas vezes leva a espirros ou tosse, o que expõe a pessoa que colhe a amostra a um risco significativo de contaminação e a obriga a proteger-se. É difícil oferecer o esfregaço nasofaríngeo repetidamente.

(2) não é necessário nenhum equipamento específico para a coleta de saliva. O equipamento de amostragem nasofaríngea (swabs) e o equipamento de protecção de amostras (bata, máscara FFP2, luvas, touca) é um factor limitativo para testes em larga escala. 


Vários bons estudos recentes mostram que a carga viral é tão elevada na saliva como o esfregaço nasofaríngeo entre casos assintomáticos e sintomáticos, e a detecção em casos assintomáticos é tão boa na saliva como o esfregaço nasal. Para um teste de rastreio fácil, sem contaminação e menos invasivo: escolha a saliva!


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Fontes de informação

Um grande número de partículas virais é encontrado na saliva coletada pelos próprios pacientes em Hong Kong. Este número diminui durante o curso da doença e depois desaparece 8-10 dias após os primeiros sintomas. De 23 pacientes, 3 foram encontrados negativos na saliva. Neste estudo, o teste PCR é um teste caseiro e a saliva recolhida de manhã após limpar a garganta e tossir.

Para, K. K. W., Tsang, O. T. Y., Yip, C. C. Y., Chan, K. H., Wu, T. C., Chan, J. M. C., ... & Lung, D. C. (2020). Detecção consistente do novo coronavírus de 2019 na saliva. Doenças Infecciosas Clínicas.

Em Melbourne, dos 622 pacientes, 39 foram positivos em esfregaços nasofaríngeos (NPS) e 33 dos 39 também foram positivos na saliva. Dos 50 PNPs negativos, um era positivo em saliva. Neste estudo, os doentes mantiveram a saliva durante 1 a 2 minutos e depois cuspiam 1 a 2 ml. 85% dos doentes positivos ao PNP tinham o vírus SRA-Cov-2 detectado na sua saliva pelo teste PNP. A quantidade de RNA detectada foi menor na saliva do que no cotonete nasal. No entanto, os resultados dos testes PCR não podem ser comparados directamente, uma vez que não são feitos exactamente da mesma forma. Em particular, a saliva deve ser primeiramente diluída em tampão fluidificante antes da extração do RNA viral. E na maioria dos estudos como este os autores não padronizam seus resultados com um controle amostral (um gene humano quantificado por PCR que permite saber a quantidade de células humanas colhidas na amostra).

Williams, E., Bond, K., Zhang, B., Putland, M., & Williamson, D. A. (2020). Saliva como espécime não invasivo para detecção da SRA-CoV-2. Journal of Clinical Microbiology

A saliva de 25 doentes críticos com Covid-19 na Unidade de Cuidados Intensivos em Varese, Itália, continha um grande número de cópias do vírus SRA-Cov-2. Neste estudo, a saliva foi recuperada usando uma pipeta colocada na boca do paciente. Para dois dos pacientes a saliva foi positiva, mas não o PNP, o que parece ser, portanto, um teste menos sensível. Um estudo recente deste grupo italiano confirma dois outros pacientes que eram saliva positiva, mas PNP negativo.

Azzi, L., Carcano, G., Gianfagna, F., Grossi, P., Dalla Gasperina, D., Genoni, A., ... & Maurino, V. (2020). Saliva is a reliable tool to detect SARS-CoV-2. Journal of Infection.

A sensibilidade e especificidade do teste RT-PCR da saliva foram de 84% e 99% respectivamente, usando o teste PNP como referência, em 200 pacientes em um hospital de Bangkok. Neste estudo, o esfregaço bucal foi recuperado após a tosse forçada.

Pasomsub, E., Watcharanananan, S. P., Boonyawat, K., Janchompoo, P., Wongtabtim, G., Suksuwan, W., ... & Phuphuakrat, A. (2020). Amostra de saliva como amostra não invasiva para o diagnóstico de doença coronavírus -2019 (COVID-19): um estudo de corte transversal. Microbiologia Clínica e Infecção.

Em um grupo de pacientes (88) e convalescentes não-hospitalizados (24) da Califórnia, a sensibilidade do teste de saliva foi comparada à do teste de PNP. Dos 88 pacientes, 98% eram PNP positivo e 69% eram saliva positiva. Dos 24 convalescentes, 4 eram saliva positiva e PNP positivo, 5 eram PNP positivo mas saliva negativa e 1 era saliva negativa. As limitações deste estudo incluem a falta de dados clínicos sobre os pacientes, o fato de que os testes foram realizados em 3 locais e que a saliva foi coletada de dois kits diferentes. Lu, J., Becker, D., Sandoval, E., Amin, A., De Hoff, P., Leonetti, N., ... & Grzymski, J. (2020). A saliva é menos sensível que os esfregaços nasofaríngeos para a detecção de COVID-19 no ambiente comunitário. medRxiv.

Lu, J., Becker, D., Sandoval, E., Amin, A., De Hoff, P., Leonetti, N., ... & Grzymski, J. (2020). A saliva é menos sensível que os esfregaços nasofaríngeos para a detecção de COVID-19 no ambiente comunitário. medRxiv.

Em 76 sujeitos (10 pacientes e 66 suspeitos), a saliva foi recolhida num tubo e o vírus detectado por PCR. 8 dos 10 pacientes eram PNP positivo e saliva positiva, 1 PNP positivo e saliva negativa, e 1 PNP positivo e saliva negativa.

Iwasaki, S., Fujisawa, S., Nakakakubo, S., Kamada, K., Yamashita, Y., Fukumoto, T., ... & Hayasaka, K. (2020). Comparação da detecção do SRA-CoV-2 em esfregaço nasofaríngeo e saliva. medRxiv.

Uma meta-análise de cerca de dez artigos sobre a detecção da SRA-Cov-2 na saliva, destacando a dificuldade de comparação dadas as variações nos métodos de extracção, PCR com o uso de vários kits e a qualidade das amostras: saliva, expectoração ou amostras orofaríngeas.

Santosh, T. S., Parmar, R., Anand, H., Srikanth, K., & Saritha, M. (2020). Uma revisão do diagnóstico salivar e sua potencial implicação na detecção do Covid-19. Cureus, 12(4).

A Start-up CURATIVE em Los Angeles recebeu a aprovação da Food and Drug Administration (FDA) para testes de fluidos orais 24 horas por dia, visando um milhão de testes por semana. O teste também deverá ser utilizado no Reino Unido. A Food and Drug Administration (FDA) já tinha aprovado o primeiro teste SRA-CoV-2 em amostras de saliva desenvolvido pela Rutgers University em Nova Jersey. Um kit dedicado é enviado ao paciente, que cospe várias vezes e o devolve dentro de 48 horas ao Laboratório Rutgers Clinical Genomics, que então realiza as PCRs.

Curativo de Arranque.

Na França, o consórcio SKILLCELL, o laboratório CNRS SYS2DIAG e a VOGO anunciam a industrialização do EasyCov, um teste de triagem de saliva a ser comercializado na França e na Europa em junho. Em menos de uma hora! O teste é realizado em saliva misturada com reagentes e incubada a 65°C durante 30 min.

L'Helgouach, N, Champigneux, P, Santos Schneider, F, Molina, L, Espeut, J, Alali, M, Baptiste, J, Cardeur, L, Dubuc, B, Foulongne, V, Galtier, F, Makinson, A, Marin, G, Picot, MC, Prieux-Lejeune, A, Quenot, M, Robles, FC, Salvetat, N, Vetter, D, Reynes, J, Molina, F. EasyCOV: Detecção rápida da SRA-CoV-2 na saliva com base em LAMP.

Este estudo relata a comparação de esfregaços salivares e nasofaríngeos em 145 amostras coletadas simultaneamente no dia do diagnóstico, e 2 e 7 dias depois. Dos 145 espécimes, 19 foram positivos para saliva e 19 para nasofaríngea. Destes espécimes COVID-19, a saliva aparece como um muco muito fácil de recolher por si só e pelo menos tão sensível como a nasofaringe para a detecção da SRA CoV-2.

Byrne, RL, Kay, Kay, GA, Kontogianni, K, Brown, L, Collins, AM, Cuevas, LE, Ferreira, D, Fraser, AJ, Garrod, G, Hill, H, Menzies, S, Mitsi, E, Owen, SI, Williams, CT, Hyder-Wright, A, Adams, ER, Cubas-Atienzar, AI. A saliva oferece uma alternativa sensível, específica e não-invasiva aos swabs respiratórios superiores para o diagnóstico da SRA-CoV-2. MedRxiv, 11 de julho de 2020.

Um dos primeiros estudos publicados pelos grupos de Caridade na Alemanha mostra que os resultados sobre PNP e expectoração são muito semelhantes (todos os 7 pacientes são acompanhados ao longo do tempo após o início dos sintomas). Note que o vírus permanece na expectoração após o final dos sintomas e que o coronavírus não foi encontrado infeccioso nas fezes. A detecção do vírus na saliva e nas secreções respiratórias pode demorar mais tempo do que os sintomas:

Wölfel, R, Corman, VM, Guggemos, W, Seilmaier, M, Zange, S, Müller, MA, Niemeyer, D, Jones, TC, Vollmar, P, Rothe, C, Hoelscher, M, Bleicker, T, Brünink, S, Schneider, J, Ehmann, R, Zwirglmaier, K, Drosten, C, & Wendtner, C. Avaliação virológica de pacientes hospitalizados com COVID-2019. Natureza volume 581, páginas 465-469 (2020).

Uma meta-análise de cerca de dez artigos sobre a detecção da SRA-CoV-2 na saliva, destacando a dificuldade de comparação dadas as variações nos métodos de extracção, PCR com o uso de vários kits e a qualidade das amostras: saliva, expectoração ou amostras orofaríngeas.

Santosh, T. S., Parmar, R., Anand, H., Srikanth, K., & Saritha, M. (2020). Uma revisão do diagnóstico salivar e sua potencial implicação na detecção do Covid-19. Cureus, 12(4).

A Start-up CURATIVE em Los Angeles recebeu a aprovação da Food and Drug Administration (FDA) para testes de fluidos orais 24 horas por dia, visando um milhão de testes por semana. O teste também deverá ser utilizado no Reino Unido. A Food and Drug Administration (FDA) já tinha aprovado o primeiro teste SRA-CoV-2 em amostras de saliva desenvolvido pela Rutgers University em Nova Jersey.

Um kit dedicado é enviado ao paciente que cospe várias vezes e depois o envia de volta dentro de 48 horas ao Laboratório de Genômica Clínica da Rutgers, que então realiza as PCRs.

O kit de detecção EasyCOV usando RT-LAMP após pré-tratamento da saliva permite a detecção do SRA-CoV-2 em 40 min com uma sensibilidade de 87,5% de acordo com o seu primeiro estudo realizado em 220 pessoas.

Um total de 720 pessoas deve ser integrado até o final do estudo.

Pesquisadores da Universidade de Yale mostram que os testes de saliva são mais sensíveis do que os realizados em amostras nasofaríngeas (n = 70 pacientes com COVID):

Wyllie, A. L., Fournier, J., Casanovas-Massana, A., Campbell, M., Tokuyama, M., Vijayakumar, P., ... & Petrone, M. E. (2020). A saliva é mais sensível para a detecção da SRA-CoV-2 em doentes com COVID-19 do que os esfregaços nasofaríngeos. New England Journal of Exp. Medicine, 24 de setembro de 2020, 383: 1283-1286.

O vírus é estável na saliva durante mais de uma semana à temperatura ambiente, mais de 2 semanas a 4°C e meses no congelador a -80°C. Estas observações sugerem que um sistema de recolha simples e barato é possível:

Ott, IM, Strine, MS, Watkins, AE, Boot, M, Kalinich, CC, Harden, CA, Vogels, CBF, Casanovas-Massana, A, Moore, AJ, Muenker, MC, Nakahata, M, Tokuyama, M, Nelson, A, Fournier, J, Bermejo, S, Campbell, M, Datta, R, Dela Cruz, CS, Farhadian, SF, Ko, AI, Iwasaki, A, Grubaugh, ND, Wilen, CB, Wyllie, AL. Simplesmente saliva: a estabilidade da detecção do SRA-CoV-2 nega a necessidade de dispendiosos dispositivos de recolha.

O estudo COVISAL francês realizado na floresta amazônica da Guiana Francesa no campo em condições mal explicadas revela variações entre os grupos amostrados em condições laboratoriais (Universidade de Yale, Universidade de Hokkaido) e no campo. Este estudo, baseado em 25 casos assintomáticos, contradiz vários estudos internacionais. No entanto, no final de setembro de 2020, levou a Autoridade Nacional de Saúde francesa a realizar testes de saliva apenas em pessoas com sintomas.

Nacher, M, Mergeay-Fabre, M, Blanchet, D, Benois, O, Pozl, T, Mesphoule, P, Sainte-Rose, V, V, Vialette, V, Toulet, B, Moua, A, Simon, S, Guidarelli, M, Galindo, M, Biche, B, Faurous, W, Abad, F, Fahrasmane, A, Rochemont, D, Vignier, N, Vabret, A, Demar, M. COVISAL Guyane, Nacher, M, Demar, M. Comparação prospectiva da saliva e amostra de esfregaço nasofaríngeo para triagem em massa para COVID-19.

O agrupamento das amostras dentro de um agregado familiar pode optimizar a detecção de surtos infectados na população:

Hogan, C. A., Sahoo, M. K., & Pinsky, B. A. (2020). Sample Pooling as a Strategy to Detect Community Transmission of SARS-CoV-2. JAMA.

Um estudo japonês recente com 55 casos assintomáticos de COVID mostra que a saliva é um método de amostragem muito eficiente para detectar CoV-2-SARS mesmo em pacientes assintomáticos:

92% de sensibilidade para amostragem salivar e 86% para amostragem nasofaríngea, com uma probabilidade de concordância de 99,8%. Os testes foram realizados em mais de 1950 pessoas em contato ou na chegada aos aeroportos: Yokota, I, Shane, P, Okada, K, Unoki, Y, Yang Y, Tasuku, I, Sakamaki, K, Iwasaki, S, Hayasaka, K, Sugita, J, Nishida, M, Fujisawa, S, Teshima, T. (2020). Rastreio em massa de pessoas assintomáticas para a SRA-CoV-2 usando saliva. 10.1101/2020.08.13.20174078.

Um estudo japonês de 103 casos positivos comparando diferentes sistemas RT-qPCR e um sistema RT-LAMP conclui que a sensibilidade do RT-qPCR é melhor. Note-se que neste estudo não houve pré-tratamento da saliva antes da RT-LAMP, o que poderia afetar os resultados obtidos.

Ikeda, M, Imai, K, & Tabata, S, Miyoshi, K, Mizuno, T, Murahara, N, Horiuchi, M, Kato, K, Imoto, Y, Iwata, M, Mimura, S, Ito, T & Tamura, K, Kato, Y. (2020). Avaliação clínica da saliva autocolhida por RT-qPCR, RT-qPCR direto, RT-LAMP, e um teste rápido de antígeno para diagnóstico da COVID-19. 10.1101/2020.06.06.20124123.

Testes agrupados de 5 a 20 em amostras de saliva pela equipe da Universidade de Yale, também por trás do teste SalivaDirect:

Watkins, A. E., Fenichel, E. P., Weinberger, D. M., Vogels, C. B., Brackney, D. E., Casanovas-Massana, A., ... & Cruz, C. S. D. (2020). Saliva em conjunto para aumentar a capacidade de teste da SRA-CoV-2. medRxiv.

A Universidade de Urbana Champaign desenvolveu testes de saliva para todo o seu pessoal desde o Verão de 2020 e realizou mais de 800.000 testes de saliva com RT-qPCR a partir de 14 de Novembro de 2020. Se uma piscina for positiva, o teste PCR é feito para cada pessoa da piscina.

Ranoa, DR, Holland, RL, Alnaji, FG, Green, KJ, Wang, L, Brooke, CB, Burke, MD, Fan, TM, Hergenrother, PJ. Teste Molecular Baseado em Saliva para o SRA-CoV-2 que Suprime a Extracção de RNA. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.18.159434v1

Um programa de vigilância no campus da Duke nos Estados Unidos encontrou vários casos de COVID-19 ao testar estudantes com sua saliva, 50% dos quais estavam assintomáticos com cargas virais por vezes altas.

Denny TN, Andrews L, Bonsignori M, et al. Implementação de um Programa de Testes de Vigilância Combinados para Infecções Assintomáticas da SRA-CoV-2 num Campus Universitário - Duke University, Durham, Carolina do Norte, 2 de Agosto a 11 de Outubro de 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. ePub: 17 de Novembro de 2020. DOI: http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.mm6946e1external ícone

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