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Que abordagens poderiam acelerar a triagem em larga escala?

Texto actualizado em 2020-11-01


O rastreamento de casos requer testes acelerados e generalizados. Testes simples e rápidos já estão disponíveis como alternativas aos testes de referência (esfregaço nasofaríngeo e medição por "RT-qPCR"): 1) para tornar a amostragem simples, autônoma, sem risco de contaminação e minimamente invasiva: a amostragem pode ser baseada na saliva que contém muito vírus (ver "Que amostra para testar a presença do coronavírus: nasofaríngeo ou oral? "); 2) para reduzir a duração do teste, os métodos de detecção rápida permitem a detecção directa de antigénios de vírus (os chamados testes "antigénicos"). Para não perder casos com baixa carga viral, existe outro teste com um passo de amplificação rápida: o método "RT-LAMP"; 3) para reduzir o número de testes a serem feitos para detectar casos COVID-19 em grande escala, devemos planejar a combinação das amostras em grupos, um método conhecido como "pooling". Ver "Pooling de testes ("Pooling", "Pooling"): porquê e com que objectivo? ».

NOTA: Deve ser feita uma distinção entre testes de vírus que podem dizer se você está atualmente infectado com o vírus (veja "Qual é o teste de referência para descobrir se estou infectado com CoV-2-SARS? ) e testes serológicos que lhe dizem que foi infectado com o vírus detectando a sua resposta imunológica (ver "Qual é o teste de referência para saber se estou infectado com CoV-2-SARS?"). Quais são os testes para saber se eu já tive o VIDOC-19? "»).

Os testes para a detecção do vírus nas secreções do nosso corpo podem ser altamente sensíveis utilizando um processo de amplificação do vírus (método PCR ou RT-LAMP) ou de baixa sensibilidade se o vírus for detectado directamente sem amplificação do vírus (os chamados testes "antigénicos").

Saliva: um método de recolha simples e independente que é menos susceptível de contaminação. Recentemente, testes baseados na análise da saliva demonstraram ser sensíveis devido à elevada carga viral. Como a coleta de saliva é fácil, os indivíduos podem até coletar a si mesmos.

Surpreendentemente, o vírus é muito estável na saliva: resiste mais de uma semana à temperatura ambiente, mais de 2 semanas a 4°C e meses no congelador a -80°C. Assim, o sistema de coleta de amostras de saliva pode ser simples e barato.

Por todas estas razões, os testes de saliva são muito promissores para testes rápidos e em larga escala. Veja a pergunta " Que amostra para testar o coronavírus: nasofaríngea ou oral? ».

Menos testes para identificar casos positivos e reduzir os custos dos testes através do agrupamento de amostras. A combinação de amostras de várias pessoas do mesmo agregado familiar num único grupo poderia optimizar a detecção de surtos infectados na população. Veja as perguntas " Testes de Pooling : por que e por que não? "e "Quais são os riscos de falsos negativos nos testes combinados? ». A técnica de agrupamento de amostras reduz o número de testes PCR padrão que precisam ser realizados e, assim, economiza tempo e eficiência na detecção de casos, além de reduzir custos. É possível juntar amostras, testar piscinas e, em caso de positividade, voltar a testar indivíduos separadamente.

Detecção do vírus por amplificação rápida da sequência viral para triagem individual e coletiva: o método RT-LAMP e a esperança da abordagem LAMP-seq. 

Existem testes baseados na reação em cadeia da polimerase ("PCR") que são mais rápidos que RT-qPCR, como RT-LAMP que é uma técnica de amplificação isotérmica mediada por laço que pode ser realizada em meia hora. Este método pode ser usado para triagem individual e é comercializado na França para amostras de saliva pela empresa SkillCell (teste "EasyCov").

O método RT-LAMP foi adaptado em uma recente prova de conceito para a triagem em larga escala: a abordagem LAMPseq. Ao adicionar "códigos de barras" na amostra de cada indivíduo, é possível combinar amostras de vários indivíduos (até dezenas de milhares) e identificar o resultado de cada um num único teste! O código de barras é uma pequena sequência de ADN colada a primários que são usados para amplificar o genoma do vírus. Assim, se uma das amostras contiver o coronavírus, a sequência viral será amplificada ao mesmo tempo que o código de barras de identificação do indivíduo. Através de sequenciamento massivo, é possível rastrear o vírus até a pessoa que o transporta dentro da piscina. O "LAMPseq" requer necessariamente mais tempo do que a meia hora de RT-LAMP para processar as dezenas de milhares de amostras, para sequenciar e interpretar as sequências. Por outro lado, com esta abordagem não é necessário voltar a testar as mesmas amostras, uma vez que a identidade de cada indivíduo no conjunto de amostras é conhecida graças ao código de barras. Note que a taxa de positividade dos casos COVID-19 na população testada impõe restrições ao número de amostras a serem combinadas com este método.

Encontrar rapidamente casos positivos altamente contaminantes detectando moléculas presentes na superfície do vírus: testes antigênicos rápidos mas de baixa sensibilidade. Enquanto os testes PCR detectam o material genético do SRA-CoV-2 (RNA), os testes antigénicos detectam as moléculas presentes na superfície do vírus, normalmente a proteína nucleocapsidar. Estes testes são rápidos (menos de 30 minutos) e, portanto, podem ser úteis para detectar pessoas com uma carga viral elevada que se espera que infectem eficazmente durante um evento de massa. Estes testes são altamente específicos para o vírus, mas não são tão sensíveis como as medidas baseadas em PCR que detectam a sequência de vírus após um processo de amplificação. Portanto, há um risco maior de se cometerem erros falso-negativos com estes testes antigênicos. Devido à baixa sensibilidade destes testes, os indivíduos sintomáticos ou casos de contacto com um teste antigénico negativo são encorajados a confirmar os seus resultados com um teste PCR mais sensível.


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Fontes de informação

Um dos primeiros estudos que indicam a fiabilidade dos testes de saliva.

Azzi, L., Carcano, G., Gianfagna, F., Grossi, P., Dalla Gasperina, D., Genoni, A., ... & Maurino, V. (2020). Saliva is a reliable tool to detect SARS-CoV-2. Journal of Infection.

Um dos primeiros estudos que indicam a fiabilidade dos testes de saliva.

Williams, E., Bond, K., Zhang, B., Putland, M., Williamson, D.A. (2020) Saliva as a non-invasive specimen for detection of SARS-CoV-2. J Clin Microbiol. pii: JCM.00776-20.

Pesquisadores da Universidade de Yale mostram que os testes de saliva são mais sensíveis do que os realizados em amostras nasofaríngeas (n = 70 pacientes com COVID):

Wyllie, A. L., Fournier, J., Casanovas-Massana, A., Campbell, M., Tokuyama, M., Vijayakumar, P., ... & Petrone, M. E. (2020). A saliva é mais sensível para a detecção da SRA-CoV-2 em doentes com COVID-19 do que os esfregaços nasofaríngeos. New England Journal of Exp. Medicine, 24 de setembro de 2020, 383: 1283-1286.

O vírus é estável na saliva durante mais de uma semana à temperatura ambiente, mais de 2 semanas a 4°C e meses no congelador a -80°C. Estas observações sugerem que um sistema de recolha simples e barato é possível:

Ott, IM, Strine, MS, Watkins, AE, Boot, M, Kalinich, CC, Harden, CA, Vogels, CBF, Casanovas-Massana, A, Moore, AJ, Muenker, MC, Nakahata, M, Tokuyama, M, Nelson, A, Fournier, J, Bermejo, S, Campbell, M, Datta, R, Dela Cruz, CS, Farhadian, SF, Ko, AI, Iwasaki, A, Grubaugh, ND, Wilen, CB, Wyllie, AL. Simplesmente saliva: a estabilidade da detecção do SRA-CoV-2 nega a necessidade de dispendiosos dispositivos de recolha.

O estudo COVISAL francês realizado na floresta amazônica na Guiana Francesa mostra o interesse e a facilidade da coleta de saliva. O estudo de campo revela variações entre os grupos amostrados em condições laboratoriais (Universidade de Yale, Universidade de Hokkaido) e no campo. Este estudo, baseado em 25 casos assintomáticos, levou a Haute Autorité de Santé a realizar testes salivares apenas em pessoas com sintomas (https://www.has-sante.fr/jcms/p_3202317/fr/covid-19-les-tests-salivaires-peuvent-completer-les-tests-nasopharynges-chez-les-personnes-symptomatiques).

Nacher, M, Mergeay-Fabre, M, Blanchet, D, Benois, O, Pozl, T, Mesphoule, P, Sainte-Rose, V, V, Vialette, V, Toulet, B, Moua, A, Simon, S, Guidarelli, M, Galindo, M, Biche, B, Faurous, W, Abad, F, Fahrasmane, A, Rochemont, D, Vignier, N, Vabret, A, Demar, M. COVISAL Guyane, Nacher, M, Demar, M. Comparação prospectiva da saliva e amostra de esfregaço nasofaríngeo para triagem em massa para COVID-19. COVISAL Guyane, Nacher, M, Demar, M. Comparação prospectiva da saliva e amostra de esfregaço nasofaríngeo para triagem em massa para COVID-19.

O agrupamento das amostras dentro de um agregado familiar pode optimizar a detecção de surtos infectados na população:

Hogan, C. A., Sahoo, M. K., & Pinsky, B. A. (2020). Sample Pooling as a Strategy to Detect Community Transmission of SARS-CoV-2. JAMA.

Um estudo japonês recente de 55 casos de COVID assintomáticos mostra que a saliva é um método de coleta muito eficiente para detectar CoV-2-SARS mesmo em pacientes assintomáticos: 92% de sensibilidade para coleta de saliva e 86% de sensibilidade para amostragem nasofaríngea, com uma probabilidade de concordância de 99,8%. Os testes foram realizados em mais de 1950 pessoas de contato ou na chegada aos aeroportos:

Yokota, I, Shane, P, Okada, K, Unoki, Y, Yang Y, Tasuku, I, Sakamaki, K, Iwasaki, S, Hayasaka, K, Sugita, J, Nishida, M, Fujisawa, S, Teshima, T. (2020). Rastreio em massa de pessoas assintomáticas para a SRA-CoV-2 usando saliva. 10.1101/2020.08.13.20174078.

Um estudo japonês de 103 casos positivos comparando diferentes sistemas RT-qPCR e um sistema RT-LAMP conclui que a sensibilidade do RT-qPCR é melhor. Note-se que neste estudo não houve pré-tratamento da saliva antes da RT-LAMP, o que poderia afetar os resultados obtidos.

Ikeda, M, Imai, K, & Tabata, S, Miyoshi, K, Mizuno, T, Murahara, N, Horiuchi, M, Kato, K, Imoto, Y, Iwata, M, Mimura, S, Ito, T & Tamura, K, Kato, Y. (2020). Avaliação clínica da saliva autocolhida por RT-qPCR, RT-qPCR direto, RT-LAMP, e um teste rápido de antígeno para diagnóstico da COVID-19. 10.1101/2020.06.06.20124123.

O kit de detecção EasyCOV usando RT-LAMP após pré-tratamento da saliva permite a detecção da SRA-Cov-2 em 40 min com uma sensibilidade de 87,5% de acordo com o seu primeiro estudo realizado em 220 pessoas.

Um total de 720 pessoas deve ser integrado até o final do estudo.

A técnica LAMP-Seq foi desenvolvida e validada em um grupo de 28 indivíduos, dos quais 12 eram RT-PCR positivos. 12 em cada 12 indivíduos foram identificados como positivos com a abordagem do LAMP-Seq. As taxas de falsos-negativos e falsos-positivos dependerão das condições precisas de implementação e impõem restrições à taxa máxima de casos positivos na população-alvo:

Schmid-Burgk, JL, Schmithausen, RM, Li, D, Hollstein, R, Ben-Shmuel, A, Israelita, O, Weiss, S, Paran, N, Wilbring, G, Liebing, J, Feldman, D, Słabicki, M, Lippke, B, Sib, E, Borrajo, J, Strecker, J, Reinhardt, J, Hoffmann, P, Cleary, P, Hölzel, M, Nöthen, MM, Exner, M, Ludwig, KU, Regev, A, Zhang, F. LAMP-Seq: Diagnóstico em escala populacional COVID-19 usando código de barras combinatório.

Testes agrupados de 5 a 20 em amostras de saliva pela equipe da Universidade de Yale, também por trás do teste SalivaDirect:

Watkins, A. E., Fenichel, E. P., Weinberger, D. M., Vogels, C. B., Brackney, D. E., Casanovas-Massana, A., ... & Cruz, C. S. D. (2020). Saliva em conjunto para aumentar a capacidade de teste da SRA-CoV-2. medRxiv.

Testes agrupados de 5 a 30 na Alemanha, no Sarre, para fins de prevenção de epidemias :

Lohse, S., Pfuhl, T., Berkó-Göttel, B., Rissland, J., Geißler, T., Gärtner, B., ... & Smola, S. (2020). Piscina de amostras para teste da SRA-CoV-2 em pessoas assintomáticas. As Doenças Infecciosas de Lancet.

Um estudo examina a especificidade e sensibilidade do teste antigênico rápido "Coris COVID-19 Ag Respi-Strip" em 106 amostras: se o teste é específico (100%), a taxa de detecção de casos positivos é muito baixa (30%).

Scohy, A., Anantharajah, A., Bodéus, M., Kabamba-Mukadi, B., Verroken, A., & Rodriguez-Villalobos, H. (2020). Baixo desempenho do teste de detecção rápida de antígenos como teste de linha de frente para o diagnóstico COVID-19. Journal of clinical virology: a publicação oficial da Sociedade Pan-Americana de Virologia Clínica, 129, 104455.

Um estudo japonês examinando o desempenho do teste antigénico LUMILUSTRE em 313 amostras revelou que estes testes são altamente específicos para a SRA-CoV-2 (especificidade de 99,6%) mas não muito sensíveis (sensibilidade de 55,2% em comparação com os testes PCR para detecção de vírus).

Hirotsu, Y, Maejima, M, Shibusawa, M, Nagakubo, Y, Hosaka, K, Amemiya, K, Sueki, H, H, Hayakawa, M, M, Mochizuki, H,Tsutsui, T, Kakizaki, Y, Miyashita, Y, Yagi, S, Kojima, S, Omata, M. Comparação do teste automático do antigénio SRA-CoV-2 para a infecção por COVID-19 com RT-PCR quantitativo usando 313 esfregaços nasofaríngeos, incluindo de sete doentes seguidos em série. Int J Infect Dis. 2020 Out; 99: 397-402. doi: 10.1016/j.ijid.2020.08.029

Os imunoensaios de fluorescência rápida do antigénio CoV-2 da SRA podem identificar doentes nos primeiros 5 dias do início dos sintomas quando as secreções respiratórias transportam elevadas cargas virais, sugerindo que estes testes podem desempenhar um papel importante em futuras estratégias independentes de PCR para detectar casos precoces ou infecciosos:

Porte, L, Legarraga, P, Iruretagoyena, M, Vollrath, V, Pizarro, G, Munita, JM, Araos, R, Weitzel, T. Rapid SARS-CoV-2 antigen detection by immunofluorescence - uma nova ferramenta para detectar a infecciosidade

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